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Modele de bolta cu vita de vie

Les analyses d`immunofluorescence ont utilisé les anticorps suivants: Rabbit anti-TH (Millipore AB152; 1:200 sur les sections; 1:100 sur les faisceaux de fibres; 1:50 sur les montures entières; Merck, Darmstadt, Allemagne), Rabbit anti VAChT (#139103; 1:500 sur les sections; 1:200 sur les montures entières; Synaptic Systems, Göttingen, Allemagne), lapin anti-NPY (#11976; 1:200 sur les sections; Technologies de signalisation cellulaire, Francfort-sur-le-main, Allemagne), lapin anti-β2AR (SC-569; 1:200 sur les sections; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Allemagne), lapin anti-NFL (#171002; 1:200 sur des montures entières; Synaptic Systems, Göttingen, Allemagne), souris à chaîne lourde anti-myosine-type I (1:100, [32]); chaîne lourde anti-myosine-type IIa (1:100; [32]) et anti-myosine de type chaîne lourde IIb (1:100, [32]), chèvre anti-souris AlexaFluor555 (Dianova, Hambourg, Allemagne), âne anti-lapin AlexaFluor 488 (1:1000 sur les sections; 1:200 sur les montures entières (P0), 1:100 (); Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne). Les AChR ont été étiquetés avec BGT-AlexaFluor 647 (Life Technologies {„type”: „entrez-nucleotide”, „attrs”: {„texte”: „B35450”, „term_id”: „2534819”, „term_text”: „B35450”}} B35450; 1:1000 sur les sections; 1:200 sur les montures entières (P0), 1:100 (2, 8); Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne), les vaisseaux sanguins ont été colorés avec la lectin-B4 conjuguée au FITC (VEC-FL-1201, [33]; 1:100; Biozol, Eching, Allemagne). (a) pour l`analyse des faisceaux de fibres, les muscles ont été récoltés, fixés en PFA à 4% pendant 5 min et les petits faisceaux de fibres ont été disséqué dans du PBS stérile sous un stéréomicroscope. Les fibres ont été incubées en 50 mM NH4Cl pendant 30 min, suivies d`un lavage en PBS. Les fibres ont été perméabilisées dans le PBS supplémenté avec 0,5% de Triton-100X pendant 2 h à température ambiante et incubées pendant la nuit avec l`anticorps primaire dilué dans le PBS additionné de 2% de BSA et de 0,5% de Triton-100X à 4 ° c. Après trois lavages au PBS, les fibres ont été incubées avec l`anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. À la fin de la procédure, les fibres ont été incubées avec du BGT pendant 2 h à température ambiante à une agitation lente. Les fibres ont ensuite été analysées au microscope confocale; b pour l`immunofluorescence des cryosections, les muscles ont été échantillonnés, chimiquement fixés en PFA à 4% (pendant la nuit, 4 ° c) et coupés en tranches d`une épaisseur de 8 μm. Les sections ont été lavées avec 1 × PBS (10 min), perméabilized avec 0,1% Triton-100X/PBS (10 min), lavé avec 1 × PBS (3 × 5 min), et bloqué avec 2% BSA/PBS (2 h, 4 ° c). Ensuite, des sections ont été incubées avec des anticorps primaires dans 2% de BSA/PBS (nuit, 4 ° c).

Après le lavage avec du PBS (3 × 10 min), les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires et des BGT dans 2% de BSA/PBS (1 h) suivies d`un lavage avec du PBS (3 × 10 min). Les diapositives ont été incorporées dans Mowiol; (c) pour l`immunofluorescence de montures entières, les membranes ont été fixées chimiquement en PFA à 4% (24 h, 4 ° c).

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